生物科學生物技術系列：基因工程

第1章 緒論1
1.1基因工程的基本概念1
1.2基因工程的理論和技術1
1.2.1基因工程所依賴的核心理論1
1.2.2基因工程所依賴的核心技術2
1.3基因工程的建立與發展2
1.3.1基因工程的建立2
1.3.2基因工程的發展3
1.4基因工程的產業化及應用6
1.4.1產業化6
1.4.2基因工程的應用7
1.5轉基因生物的安全性與倫理9
1.5.1轉基因生物的安全性9
1.5.2轉基因生物的倫理11
1.6應用事例12
1.6.1問題的提出12
1.6.2生化產品生產中存在的問題12
1.6.3基因工程的用途13
1.6.4實例13

第2章 基因14
2.1「遺傳因子」——生物性狀遺傳的符號14
2.2基因——位於染色體上的遺傳功能單位14
2.2.1等位基因14
2.2.2復等位基因15
2.3順反子——一個基因一條多肽17
2.4操縱子——遺傳信息傳遞和表達的統一體18
2.5超基因20
2.6假基因21
2.7斷裂基因22
2.7.1RNA剪接22
2.7.2內含子的類型24
2.8重疊基因27
2.9可動基因29
2.9.1Ac—Ds系統29
2.9.2插入序列29
2.9.3轉座子31
2.9.4P因子34
2.9.5反轉錄轉座子35
2.10癌基因和抑癌基因36
2.11染色體外基因37
2.11.1質粒37
2.11.2線粒體基因37
2.11.3葉綠體基因39
2.11.4非孟德爾遺傳39

第3章 工具酶41
3.1限制性核酸內切酶41
3.1.1宿主的限制和修飾現象41
3.1.2限制性核酸內切酶的類型42
3.1.3限制性核酸內切酶的命名46
3.1.4影響限制性核酸內切酶活性的因素46
3.1.5限制性核酸內切酶對DNA的消化作用48
3.1.6限制性核酸內切酶反應的終止49
3.1.7限制性核酸內切酶酶切反應的操作步驟和注意事項49
3.2DNA聚合酶50
3.2.1DNA聚合酶Ⅰ（E.coli）51
3.2.2大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段52
3.2.3T4DNA聚合酶52
3.2.4依賴於RNA的DNA聚合酶53
3.2.5T7DNA聚合酶53
3.2.6修飾的T7DNA聚合酶53
3.3DNA連接酶54
3.3.1大腸桿菌和T4噬菌體的DNA連接酶54
3.3.2影響連接反應的因素55
3.3.3DNA片段在體內和體外的連接——黏性末端的連接55
3.3.4平齊末端的連接57
3.3.5連接反應的注意事項59
3.4DNA及RNA的修飾酶59
3.4.1末端脫氧核苷酸轉移酶59
3.4.2T4多核苷酸激酶60
3.4.3鹼性磷酸酶61
3.5核酸外切酶61
3.5.1核酸外切酶Ⅶ62
3.5.2核酸外切酶Ⅲ62
3.5.3λ核酸外切酶和T7基因6核酸外切酶63
3.6單鏈核酸內切酶63
3.6.1S1核酸酶63
3.6.2Bal31核酸酶64
3.7細胞裂解酶65
3.7.1溶菌酶65
3.7.2蛋白酶K65
3.7.3纖維素酶65
3.7.4其他裂解酶66
3.8其他66
3.8.1瓊脂糖酶66
3.8.2核酸酶抑制劑66

第4章 載體67
4.1質粒載體67
4.1.1質粒的一般生物學特性67
4.1.2質粒載體的選擇71
4.1.3常用的大腸桿菌質粒載體72
4.2噬菌體載體79
4.2.1單鏈噬菌體載體80
4.2.2雙鏈噬菌體載體83
4.3柯斯質粒載體89
4.3.1柯斯質粒載體的組成89
4.3.2柯斯質粒載體的特點89
4.3.3柯斯質粒載體的應用90
4.4噬菌粒載體91
4.4.1噬菌粒載體的概念91
4.4.2pUC118和pUC119噬菌粒載體92
4.4.3pBluescript噬菌粒載體92
4.5人工染色體載體93
4.5.1酵母人工染色體載體93
4.5.2細菌人工染色體載體95
4.5.3P1人工染色體載體96

第5章 重組DNA分子的轉化與重組子篩選98
5.1DNA分子的轉化與擴增98
5.1.1DNA重組轉化的基本概念98
5.1.2受體細胞的選擇99
5.1.3轉化方法101
5.1.4轉化率及其影響因素104
5.1.5轉化細胞的擴增105
5.1.6進行轉化時的注意事項105
5.2重組體克隆的篩選與鑒定105
5.2.1遺傳檢測法106
5.2.2物理檢測法110
5.2.3核酸雜交法112
5.2.4PCR檢測法115
5.2.5克隆基因定位法115
5.2.6測序檢測法117
5.2.7外源基因表達產物檢測法117

第6章 大腸桿菌基因工程120
6.1外源基因在大腸桿菌高效表達的原理120
6.1.1啟動子120
6.1.2終止子125
6.1.3核糖體結合位點126
6.1.4密碼子127
6.1.5質粒拷貝數128
6.2大腸桿菌工程菌的構建策略130
6.2.1包涵體型異源蛋白的表達130
6.2.2分泌型異源蛋白的表達133
6.2.3融合型異源蛋白的表達135
6.2.4寡聚型異源蛋白的表達138
6.2.5整合型異源蛋白的表達142
6.2.6蛋白酶抗性或缺陷型表達系統的構建143
6.3重組異源蛋白的體外復性活化145
6.3.1蛋白質變性的動力學原理145
6.3.2折疊中間狀態分子的集聚作用146
6.3.3包涵體的溶解與變性147
6.3.4異源蛋白的復性與重折疊149
6.4基因工程菌的遺傳不穩定性及其對策154
6.4.1基因工程菌遺傳不穩定性的表現與機制155
6.4.2改善基因工程菌不穩定性的策略156
6.5大腸桿菌基因工程的案例158

第7章 酵母菌基因工程163
7.1酵母菌的宿主系統163
7.1.1提高重組蛋白表達產率的突變宿主菌163
7.1.2抑制超糖基化作用的突變宿主菌164
7.1.3減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌164
7.1.4內源性蛋白酶缺陷型的突變宿主菌165
7.2酵母菌的載體系統166
7.2.1釀酒酵母的2μ環狀質粒166
7.2.2乳酸克魯維酵母的線型質粒167
7.2.3果蠅克魯維酵母的環狀質粒168
7.2.4含ARS的YRp和YEp169
7.2.5含CEN的YCp169
7.2.6穿梭載體170
7.3酵母菌的轉化系統171
7.3.1酵母菌的轉化程序172
7.3.2轉化質粒在酵母細胞中的命運172
7.3.3用於轉化子篩選的標記基因173
7.4酵母菌的表達系統175
7.4.1酵母菌啟動子的基本特征與選擇175
7.4.2酵母菌啟動子的可調控表達系統176
7.4.3外源基因在酵母菌中表達的限制因素178
7.4.4酵母菌表達系統的選擇178
7.5酵母菌基因工程的案例180

第8章 核酸的分離純化與目的基因的克隆184
8.1核酸的分離純化184
8.1.1核酸分離提取的原則184
8.1.2核酸的分離提取185
8.1.3質粒DNA的提取188
8.1.4RNA的提取189
8.1.5核酸的檢測190
8.2目的基因的克隆192
8.2.1鳥槍法192
8.2.2cDNA法195
8.2.3PCR擴增法198
8.2.4化學合成法208
8.2.5基因文庫的構建210

第9章 基因組214
9.1基因組剖析214
9.1.1基因組序列復雜性214
9.1.2原核生物基因組216
9.1.3真核生物基因組220
9.2基因組測序227
9.2.1DNA測序方法227
9.2.2基因組測序234
9.2.3序列組裝236
9.3基因組序列注釋239
9.3.1搜尋基因239
9.3.2基因注釋246
9.3.3基因功能檢測248
9.3.4高通量基因功能研究方法249
9.4功能基因組學251
9.4.1組學簡介251
9.4.2轉錄物組251
9.4.3蛋白質組252
9.4.4基因本體253
9.5基因組表觀遺傳256
9.5.1什麼是表觀遺傳256
9.5.2位置效應258
9.5.3DNA甲基化259
9.5.4染色體重建259
9.6基因組編輯260
9.6.1遺傳重組260
9.6.2基因敲除265
9.6.3新一代的基因組定點編輯技術269

第10章 蛋白質工程282
10.1蛋白質工程的基本概念282
10.1.1蛋白質工程的基本特征282
10.1.2蛋白質工程的研究內容和應用283
10.1.3蛋白質工程實施的必要條件283
10.2基因的體外定向突變284
10.2.1局部隨機摻入法284
10.2.2鹼基定點轉換法285
10.2.3部分片段合成法286
10.2.4引物定點引入法287
10.2.5PCR擴增突變法289
10.3基因的體外定向進化290
10.3.1易錯PCR291
10.3.2DNA改組291
10.3.3體外隨機引發重組291
10.3.4交錯延伸292
10.3.5過渡模板隨機嵌合生長292
10.3.6漸增切割雜合酶生成294
10.3.7同源序列非依賴性蛋白質重組295
10.3.8突變文庫的篩選模型296
10.4蛋白質工程的設計思想與應用297
10.4.1提高蛋白質或酶的穩定性297
10.4.2減少重組多肽鏈的錯誤折疊297
10.4.3改善酶的催化活性297
10.4.4消除酶的被抑制特性297
10.4.5修飾酶的催化特異性298
10.4.6強化配體與其受體的親和性298

第11章 途徑工程299
11.1途徑工程的基本概念299
11.1.1途徑工程的基本定義299
11.1.2途徑工程的基本過程300
11.1.3途徑工程的基本原理302
11.2途徑工程的研究戰略303
11.2.1在現存途徑中提高目標產物的代謝流303
11.2.2在現存途徑中改變物質流的性質304
11.2.3利用已有途徑構建新的代謝旁路305
11.3初級代謝的途徑工程305
11.3.1發酵生產乙醇的基本戰略306
11.3.2酵母菌屬乙醇發酵途徑的改良308
11.3.3高產乙醇的重組大腸桿菌的構建309
11.3.4直接利用太陽能合成乙醇的光合細菌途徑設計311
11.4次級代謝的途徑工程312
11.4.1提高次級代謝產物的手段312
11.4.2紅霉素（聚酮類抗生素）的生物合成313
11.4.3提高紅霉素A產量的策略315

附錄318
參考文獻336