內生菌研究方法

第一章內生菌的概述/1
第一節內生菌的定義與種類1
一、內生菌的定義1
二、內生菌的種類2
第二節內生菌的活性與應用4
一、內生菌的活性5
二、內生菌的應用8
參考文獻9

第二章內生菌研究方法的前期準備/14
第一節顯微鏡基礎知識及使用14
一、普通光學顯微鏡14
二、相差顯微鏡16
三、螢光顯微鏡16
四、掃描電子顯微鏡20
五、透射電子顯微鏡21
六、原子力顯微鏡22
第二節常規器具和設備23
一、常用器皿23
二、接種工具24
三、常規儀器設備24
第三節常規器具的洗滌25
一、洗滌劑26
二、器皿的洗滌26
三、載玻片和蓋玻片的洗滌26
第四節器皿的包紮和棉塞的製作27
一、移液管的包紮27
二、培養皿的包紮27
三、錐形瓶的包紮27
四、棉塞的製作28
第五節常規滅菌方法28
一、加熱滅菌法28
二、過濾除菌法30
三、輻射滅菌法30
四、化學滅菌法31
第六節常規接種方法31
一、劃線接種法31
二、穿刺接種法32
三、點接種法32
第七節培養基及其配製32
一、培養基的成分32
二、培養基的種類33
三、培養基及其配製34
參考文獻36

第三章內生菌的分離/38
第一節樣品的收集與處理38
第二節樣品的表面消毒39
第三節內生菌分離培養基的選擇41
一、內生真菌分離培養基的選擇41
二、內生細菌分離培養基的選擇42
三、內生放線菌分離培養基的選擇43
第四節內生菌的分離方法44
一、植物樣品的分離方法44
二、海洋生物樣品的分離方法45
三、昆蟲等其他生物樣品的分離方法46
第五節內生菌的分離實例46
實例一三叉苦內生真菌的分離46
實例二砂仁內生細菌的分離47
實例三變葉木、陰香內生放線菌的分離47
實例四珊瑚內生菌的分離48
實例五白蟻成蟲內生菌的分離48
參考文獻48

第四章內生菌的鑒定/51
第一節內生細菌的鑒定51
一、細菌的特徵及分類依據51
二、細菌鑒定的一般程式51
三、內生細菌鑒定方法52
四、細菌常用分類系統簡介及檢索80
第二節內生放線菌的鑒定87
一、放線菌的分類研究87
二、內生放線菌鑒定方法91
三、內生鏈黴菌種群特徵99
四、放線菌分類系統99
第三節內生真菌的鑒定103
一、真菌的特徵及分類依據103
二、內生真菌的鑒定104
參考文獻113

第五章內生菌的培養與發酵/116
第一節內生菌的培養116
一、固體培養法116
二、液體培養法118
第二節連續培養技術119
第三節同步培養技術120
一、選擇法120
二、誘導法121
第四節高密度培養技術122
一、固定化培養122
二、補料分批培養123
三、膜過濾培養技術123
第五節固體發酵技術124
第六節內生菌的發酵實例125
實例一三椏苦內生真菌SCK-Y9同步生長技術125
實例二變葉木內生細菌BYG2-5膜過濾培養125
實例三鏈黴菌HN6固體發酵技術125
參考文獻127

第六章內生菌的定殖研究/128
第一節內生菌的侵染與定殖128
一、植物內生菌的侵染方式128
二、植物內生菌的定殖129
第二節內生菌的定殖檢測129
一、抗生素標記法130
二、免疫學方法131
三、基因標記法143
四、特異性寡核苷酸片段標記法146
五、基因晶片法146
六、螢光定量PCR檢測法147
第三節內生菌的定殖研究實例147
參考文獻149

第七章內生菌的活性評價方法/151
第一節內生菌殺蟲活性評價方法151
一、觸殺作用評價方法151
二、胃毒作用評價方法152
三、蟎類的評價方法154
四、酶活評價方法155
第二節內生菌抑菌活性評價方法166
一、內生菌離體活性評價方法166
二、內生菌組織活性評價方法171
三、內生菌盆栽活性評價方法174
第三節內生菌抗氧化活性評價方法176
一、TLC法檢測自由基清除活性176
二、高價鐵離子還原作用176
三、DPPH自由基清除作用176
四、ABTS自由基清除作用177
五、超氧陰離子清除作用177
六、羥基自由基清除作用177
七、過氧化氫清除作用178
八、實例蜂巢珊瑚內生真菌的抗氧化活性研究178
第四節內生菌誘導靶標菌細胞凋亡評價方法181
一、對細胞內氧化應激的評價181
二、對線粒體膜電位的評價182
三、對靶標菌菌體內抗氧化酶系的評價182
四、對細胞內還原型谷胱甘肽含量的評價185
五、對小靶標菌細胞凋亡的誘導186
參考文獻187

第八章內生菌的促生作用/190
第一節直接促生作用190
一、生長素190
二、固氮作用192
三、解磷作用192
四、解鉀作用193
五、分泌鐵載體193
第二節間接促生作用194
一、拮抗作用194
二、誘導系統抗性194
第三節促生作用檢測198
一、形態指標檢測198
二、生理指標檢測199
第四節互作效應202
第五節內生菌促生作用研究實例203
實例一鏈黴菌HN6對香蕉的促生作用研究203
實例二放線菌HN20對黃瓜、生菜的促生作用研究205
實例三放線菌WZS1-1與WZS2-1菌株的促生作用測定208
參考文獻211

第九章內生菌代謝產物的研究/213
第一節內生菌代謝產物的分離213
一、小分子代謝產物的提取分離213
二、蛋白質的提取分離220
三、多糖的提取分離223
第二節內生菌代謝產物的鑒定225
一、定性鑒定225
二、紅外光譜分析法227
三、核磁共振波譜法228
四、質譜分析法231
五、圓二色光譜分析法232
第三節真菌Xylariafeejeenisis的代謝產物研究232
參考文獻236

第十章內生菌的應用研究/237
第一節內生菌可濕性粉劑的研製237
一、HN6可濕性粉劑的製備方法237
二、可濕性粉劑的製備方法優化239
三、HN6可濕性粉劑對香蕉枯萎病的盆栽防治效果240
四、HN6可濕性粉劑對香蕉枯萎病的田間防治效果241
第二節內生菌可溶性液劑的研製242
第三節內生菌微生物肥料的研製243
一、內生菌液體肥料的研製244
實例一枯草芽孢桿菌HBS-1和白刺鏈黴菌NLG-3的液體肥料244
實例二HN20的液體肥料244
實例三黃色鏈黴菌BYM-2的液體肥料244
實例四蜜糖草固氮螺菌SRJ2-4的液體肥料245
二、內生菌固體肥料的研製245
實例一含螢光假單胞桿菌YXG2-3的複合固體肥料245
實例二含芽孢桿菌HBS-1的複合固體肥料246
實例三含岸濱芽孢桿菌BYG2-5的複合固體肥料246
第四節內生菌保鮮劑的研製247
一、香蕉防腐保鮮劑的應用247
二、芒果防腐保鮮劑的應用248
第五節內生菌菌劑的檢測249
參考文獻252

第十一章內生菌菌種的保藏/253
第一節菌種保藏的基本原理253
第二節菌種保藏的基本方法253
一、斜面傳代保藏法253
二、礦物油保藏法254
三、麩皮保藏法254
四、沙土管保藏法255
五、土壤培養保藏法256
六、蒸餾水保藏法256
七、甘油懸液保藏法256
八、冷凍乾燥保藏法257
九、液氮超低溫保藏法257
十、素瓷珠保藏法258
十一、瓊脂穿刺保藏法258
十二、固定化保藏法258
十三、宿主保藏法259
第三節菌種保藏的注意事項259
參考文獻260

附錄262
附錄一培養基及配方262
附錄二常用酸堿指示劑的配製270
附錄三常用消毒劑的配製271

微生物從古至今，與人休戚與共，其作用之大，分佈之廣，令人驚歎。內生菌由來已久，1886年界定，研究頗多；與動植物共生，相輔相成；次生代謝物繁多，生物活性顯著；促生作用明顯，應用範圍廣泛。可贊曰：動植物資源有限，而內生菌無限也。究其價值，以菌造肥、以菌促長、以菌防病、以菌治病，攜創新之利器、領科學之前沿，使研究者後浪推前浪，前仆後繼，鍥而不捨。經作者多年潛心研學，探求研究內生細菌、真菌和放線菌之本來面目，只能說得其皮毛。於是歸納總結，整理成章，以便參考。

本書首次系統地撰寫了內生菌的研究方法，從內生菌研究的前期準備，到內生菌的分離純化；從用形態學、生理生化方法和DNA分子技術鑒定內生菌，對其進行培養與發酵，到開展內生菌的定殖研究；從內生菌的篩選，到拮抗活性和促生的評價，並挖掘內生菌的次生代謝產物；最後歸結到內生菌的應用研究，並列舉內生菌的保藏方法等。因此，望本書能給研究者以參考，給研究者指出入門之道。

本書第一章、第七章至第十一章由駱焱平著，第二章至第六章、附錄由王蘭英著。本課題組韓丹丹、王潔、陳宇豐、章傑、李花、沈恬安、張建春、吳接呈、張築宏、楊德友、楊育紅等參與本書資料收集、整理、文字編輯與校對工作，在此表示衷心的感謝。

本書的出版得到海南省高等學校科學研究專案（Hnky2017ZD-2）、海南省重點研發計畫專案（ZDYF2018230）、海南省重大科技計畫專案（ZDKJ2017002）的資助。

本書是在參考和引用國內外相關研究資料的基礎上，結合作者多年的研究成果，整理而成。由於編者水準有限，不足之處在所難免，敬請讀者批評指正。

著者
2019年6月