黃酮類化合物的合成生物學製造

第一章黃酮類化合物簡介 001
1.1黃酮類化合物 004
1.1.1黃酮類化合物的基本特性 004
1.1.2黃酮類化合物的種類 004
1.1.3黃酮類化合物的功能及市場 007
1.2黃酮類化合物的生產技術 010
1.2.1黃酮類化合物提取法生產技術 010
1.2.2黃酮類化合物化學法合成技術 014
1.2.3酶催化生物合成黃酮苷 018
1.2.4黃酮類化合物的微生物法生產技術 022

第二章黃酮類化合物合成代謝途徑的挖掘與構建 029
2.1概述 029
2.1.1黃酮平臺化合物柚皮素和生松素的合成代謝途徑 029
2.1.2常見的黃酮類化合物修飾途徑 030
2.2 組學技術驅動的水飛薊賓原生合成途徑的解析 032
2.2.1不同植物組織水飛薊賓及其前體含量差異性分析 034
2.2.2水飛薊賓合成過程的轉錄組學分析差異基因 036
2.2.3體外仿生研究及水飛薊賓全合成途徑的解析 041
2.3黃酮類骨架物質合成途徑的異位重構 047
2.3.1基於定點突變技術的途徑基因挖掘 048
2.3.2基於生物資訊學分析的途徑基因挖掘 049
2.3.3基於四質粒共表達體系的合成途徑構建與產物分析鑒定 049
2.4大腸桿菌生產黃酮類物質聖草酚的研究進展 051
2.4.1大腸桿菌以L- 酪氨酸為底物生產聖草酚的機理 051
2.4.2大腸桿菌生產黃酮類化合物聖草酚的國內外研究現狀 052
2.5 代謝工程技術強化大腸桿菌胞內丙二醯輔酶A 的研究進展 053
2.5.1丙二醯輔酶A 在聖草酚合成中的重要性 053
2.5.2代謝工程技術強化大腸桿菌胞內丙二醯輔酶A 的研究現狀 053
2.5.3代謝工程技術強化丙二醯輔酶A 的積累 054
2.5.4 可溶性表達黃酮3' - 羥化酶（F3' H）融合蛋白及平衡相應基因表達 057
2.5.5重組菌的發酵條件優化與控制 061
2.5.6優化條件下聖草酚產量與輔酶A 含量 064
2.5.7基於高效黃酮3' - 羥化酶鑒定的黃杉素合成途徑的挖掘 066
2.5.8SmF3H 的序列分析 067
2.5.9SmF3H 的功能鑒定 069
2.5.10基於啟動子優化SmF3H 表達水準 069
2.5.11在5L 發酵罐水準進行黃杉素發酵優化 070
2.6黃杉素從頭合成途徑的構建與優化 072
2.6.1黃杉素及其微生物法合成 072
2.6.2微生物法合成黃杉素的現狀與趨勢 072
2.6.3微生物法高效合成黃杉素意義 078
2.6.4黃杉素從頭合成途徑在解脂亞洛酵母中的重構 079
2.6.5黃杉素合成途徑限速步驟分析與模組化優化 082
2.6.6通過強化前體代謝流提高黃杉素合成效率 084
2.6.7發酵條件優化 086
2.7小結 087

第三章黃酮類化合物從頭合成代謝途徑的構建 089
3.1 基於高效酶級聯轉化體系的松柏醇全合成途徑的構建 089
3.1.1過氧化氫對香草醇氧化酶的抑制及松柏醇的過度氧化作用 090
3.1.2過氧化氫酶的表達與分析 092
3.1.3強化過氧化氫酶活性的松柏醇酶級聯轉化體系分析 093
3.1.4體系條件優化及3L 發酵罐發酵 093
3.2高效水飛薊賓體外合成新途徑構建 096
3.2.1過氧化物酶的選擇及其催化水飛薊賓合成的功能分析 097
3.2.2酶級聯的設計與構建 100
3.2.3血紅素合成過程的強化 102
3.2.4體外反應條件優化 102
3.3基於限速分析的柚皮素從頭合成途徑的構建 106
3.3.1柚皮素從頭合成菌株的構建 107
3.3.2莽草酸途徑對柚皮素積累的影響 109
3.3.3外源基因表達強度對柚皮素積累的影響 110
3.3.4發酵罐水準優化柚皮素積累 110
3.4益生酵母的對香豆酸合成途徑的構建 111
3.4.1對香豆酸及其衍生物 111
3.4.2對香豆酸及其衍生物的生物合成 113
3.4.3釀酒酵母合成天然產物 119
3.4.4產對香豆酸釀酒酵母工程菌株的構建 122
3.4.5釀酒酵母生產對香豆酸合成途徑的優化 126
3.4.6釀酒酵母生產對香豆酸的發酵優化 131
3.5基於酵母整合包的黃杉素從頭合成途徑構建 135
3.5.1構建Ty 表達包 137
3.5.2Ty 表達包的整合能力驗證 138
3.5.3單位點Ty 整合菌株生產能力的鑒定 140
3.5.4丙二醯輔酶A 途徑對柚皮素和黃杉素積累的影響 141
3.5.5三位點Ty 整合菌株從頭合成黃杉素的能力 142
3.5.6在5L 發酵罐中從頭合成黃杉素 144
3.6小結 144

第四章黃酮類化合物代謝途徑的理性調控策略 147
4.1概述 147
4.1.1微生物代謝途徑的傳統調控方法 147
4.1.2微生物代謝途徑的精細調控策略 148
4.2基於模組化代謝途徑關鍵基因上調策略 148
4.2.1黃酮骨架物質總合成途徑的模組劃分 148
4.2.2黃酮骨架物質總合成途徑的瓶頸步驟分析 149
4.2.3特異模組的精細劃分改造瓶頸步驟 150
4.2.4模組化的單獨優化 151
4.2.5芳香族氨基酸合成黃酮骨架物質途徑的整合 152
4.3基於內源啟動子的基因上調策略 154
4.3.1啟動子-5' - 非轉錄區域（PUTR）文庫篩選與準備 154
4.3.2PUTR 轉錄特性研究 157
4.3.3細胞生長不同時期PUTR 蛋白質表達特性研究 158
4.3.4相同PUTR 螢光蛋白表達與mRNA 轉錄水準對比 159
4.3.5啟動子工程構建高強度PUTR 161
4.3.6工程化PUTR 普適性研究 163
4.4 基於反義RNA 的脂肪酸代謝途徑關鍵基因下調策略 164
4.4.1起始反義RNA 表達系統的構建 165
4.4.2反義RNA 不同結合區域對抑制效率的影響 166
4.4.3反義RNA 系統對於胞內脂肪酸含量的影響 168
4.4.4反義RNA 系統協同抑制fabB 和fabF 基因 168
4.4.5反義RNA 系統對胞內丙二醯輔酶A 濃度的影響 170
4.4.6反義RNA 系統對柚皮素產量的影響 171
4.4.7反義RNA 系統對生松素產量的影響 172
4.5 基於CRISPR/dCas9 的中心代謝途徑關鍵基因下調策略 174
4.5.1CRISPR 干擾系統的構建 176
4.5.2利用CRISPR 干擾系統鑒定出與丙二醯輔酶A 合成相關的基因 177
4.5.3菌體生長和丙二醯輔酶A 合成的協調 178
4.5.4單個基因抑制對於柚皮素產量的影響 181
4.5.5多個基因抑制對於柚皮素產量的影響 182
4.5.6單個或多個基因抑制對於生松素產量的影響 182
4.6小結 184

第五章黃酮類化合物合成過程的半理性調控策略 187
5.1概述 187
5.1.1黃酮及其中間代謝產物的高效檢測方法 187
5.1.2微生物高效積累目標產物的高通量篩選策略 187
5.2 定向改造技術驅動的高效對香豆酸合成菌株的構建 188
5.2.1對香豆酸簡介 188
5.2.2酪氨酸解氨酶的研究進展 189
5.2.3定向進化方法概述 191
5.2.4酪氨酸解氨酶高通量篩選方法的建立 192
5.2.5隨機突變改造酪氨酸解氨酶 197
5.2.6突變位點的單一及疊加突變與分析 201
5.3 黃酮類化合物及其中間代謝產物的半理性篩選策略 205
5.3.1柚皮素、對香豆酸和L- 酪氨酸的紫外- 可見光光波譜學特性 206
5.3.2柚皮素、對香豆酸和L- 酪氨酸的螢光光譜學特性 206
5.3.3柚皮素檢測條件優化 208
5.3.4中間產物干擾性驗證 209
5.3.5TtgR 對柚皮素濃度回應特性研究 210
5.3.6基於TtgR 的超高通量篩選方法 211
5.3.7質粒文庫多樣性驗證 213
5.3.8柚皮素高產菌株第一輪高通量篩選 216
5.3.9柚皮素高產菌株反覆運算高通量篩選 217
5.3.10柚皮素合成關鍵代謝節點解析 218
5.4小結 219

第六章黃酮類化合物生物合成途徑的動態調控策略 221
6.1概述 221
6.1.1代謝網路的動態調控策略 221
6.1.2生物感測器及其在代謝網路調控中的應用 222
6.2 基於CRISPRi 的脂肪酸動態調控黃杉素前體代謝途徑 223
6.2.1隨機和定點整合方法的構建 224
6.2.2脂肪酸誘導型啟動子分析 228
6.2.3sgRNA 單靶點阻遏效果分析 228
6.2.4多基因組合阻遏效果分析 230
6.2.5脂肪酸合成動態調控下黃杉素與脂肪酸合成 231
6.3柚皮素合成過程的動態調控 232
6.3.1柚皮素回應啟動子結構研究 233
6.3.2對香豆酸回應啟動子結構研究 235
6.3.3柚皮素動態調控模組放大效應 236
6.3.4脂肪酸代謝途徑優化 238
6.3.5丙二醯CoA 來源代謝途徑優化 240
6.3.6雙動態調控系統組合發酵 242
6.3.7文庫構建與轉化效率檢測 243
6.3.8高通量篩選柚皮素高產菌株 243
6.4小結 248

第七章黃酮類化合物轉運途徑的發掘 251
7.1概述 251
7.1.1苯丙素類化合物簡介 251
7.1.2利用大腸桿菌生產苯丙素類化合物的可行性及限制因素 252
7.2膜蛋白質組學 254
7.2.1蛋白質組學簡介 254
7.2.2蛋白質組學的主要研究技術及技術路線 255
7.2.3蛋白質組學在大腸桿菌中的應用 258
7.3 大腸桿菌AraE 蛋白對苯丙素類化合物轉運的情況 259
7.3.1araE 基因過量表達和基因沉默菌株構建及驗證 259
7.3.2過量表達和沉默araE 基因對大腸桿菌苯丙素類化合物轉運的影響 260
7.4E .coli BL21（DE3）膜蛋白質組學雙向電泳方法優化 262
7.4.1不同蛋白質純化方法對雙向電泳結果的影響 262
7.4.2不同凝膠參數的確定 263
7.5 不同苯丙素類化合物刺激下E.coli BL21（DE3）膜蛋白質組學研究結果 264
7.5.1不同苯丙素類化合物對E.coli BL21（DE3）膜蛋白表達的影響 264
7.5.2差異表達蛋白質的鑒定及鑒定結果分析 266
7.5.3關鍵差異蛋白質的分析及定量PCR 驗證 269
7.6E.coli BL21（DE3）中鑒定關鍵膜蛋白對苯丙素類化合物耐受性的影響 270
7.6.1關鍵蛋白質基因過量表達菌株的構建 270
7.6.2 過量表達膜蛋白基因對E.coli BL21（DE3）苯丙素類化合物耐受性的影響 271
7.6.3關鍵蛋白質基因沉默菌株的構建 274
7.6.4 沉默膜蛋白基因對E.coli BL21（DE3）苯丙素類化合物耐受性的影響 277
7.7小結 279

第八章合成生物學製造黃酮類天然產物的工業化展望 281
8.1化學品綠色製造核心技術——合成生物學 281
8.2合成生物學與代謝工程育種新方法 281
8.2.1代謝途徑精細調控策略的深入研發 281
8.2.2合成生物學在微生物系統定向進化中的應用 283
8.2.3體外合成生物學的應用 287
8.3展望 290
參考文獻 292

發酵工程是當代工業生物技術的重要領域和組成部分。系統生物學、代謝工程和合成生物學技術的飛速發展，使得人們可以採用更多的策略改造微生物生產更多種類的目標產物，極大地拓展了發酵工程的應用範圍。

黃酮類化合物是一類重要的植物次級代謝產物，廣泛存在於植物的各種組織中，説明植物抵抗細菌、真菌等侵入，是植物防禦系統的重要組成部分。花青素類黃酮類化合物賦予植物花、果實、葉子等以豐富多彩的顏色。黃酮類化合物種類繁多，已經被鑒定的種類超過5000種，很多具有非常重要的用途。黃酮類化合物具有多種調節人體生理功能的特性，如水飛薊賓和二氫楊梅素等可以緩解肝臟毒性，大豆異黃酮等可以減輕更年期症狀，淫羊藿苷等可以預防中老年骨質疏鬆症等。由於天然植物中黃酮類化合物的含量普遍較低，導致價格奇高、供應短缺，嚴重限制了很多具有明確功能的黃酮類化合物在食品、醫藥、飼料和化妝品中的廣泛應用。黃酮類化合物由於代謝途徑長、前體來源多，也被很多研究者作為合成生物學研究的一類重要目標產物，建立了很多重要的合成生物學理論與方法。

作者團隊自2010年開始，在國家973計畫、863計畫、國家自然科學基金項目、江蘇省自然科學基金重點專案等的支援下，利用系統生物學方法挖掘水飛薊賓和淫羊藿苷等複雜黃酮類化合物的合成代謝途徑，開發靜態和動態精細調控策略優化黃酮類化合物合成代謝途徑，結合對轉運途徑的分析和發酵過程優化，實現了多種黃酮類化合物的高效合成，形成了4篇博士學位論文和6篇碩士學位論文，這些學位論文正是本書的主體。研究工作也得到了美國唐納德植物科學中心（McDonaldDanforthPlantScienceCenter）的OliverYu教授、倫斯勒理工學院（RensselaerPolytechnicInstitute）的MattheosAGKoffas教授、得州大學奧斯丁分校（UniversityofTaxasatAustin）的HalAlper教授、馬里蘭大學巴爾的摩分校（UniversityofMarylandatBaltimoreCounty）的PengXu博士等的大力支持。在本書編寫工作中也大量參考了近年來在國內外學術期刊、行業期刊、相關專著以及互聯網發表的研究論文、綜述文章和市場分析等成果，在此一併致謝。作者以黃酮類化合物為載體，運用了大量最新的生物技術理論與方法，相信本書不僅可以為從事植物天然產物研究的讀者提供參考，也可以為從事代謝工程與合成生物學生產其他產物的讀者提供分析問題和解決問題的思路與方法。

參與本書中部分章節寫作的有：周景文、陳堅、吳俊俊、呂永坤、周勝虎、高松、朱賽傑、王奎、劉沛然、張思琪、李廣健等。作者特別感謝中國工程院院士、江南大學生物工程學院倫世儀教授的鼓勵和指導，感謝所在研究室的老師、博士後、博士和碩士研究生給予的幫助。

作者力圖在本書中注重結合理論性和實踐性，突出理論與方法的普適性，體現前沿性和創新性，但限於作者的學術功底、研究經驗和寫作能力，書中存有疏漏和不妥，若蒙賜教，不勝感激！

作者
2021年10月