內容簡介

《基因工程——動物細胞製藥關鍵技術》圍繞動物細胞表達系統生產重組蛋白質藥物的關鍵技術，從動物細胞培養、動物細胞載體、目的基因導入、重組穩定細胞株篩選和評估、重組蛋白分離純化、重組蛋白藥物鑒定與分析、重組蛋白藥物新技術等方面，詳細介紹了該領域的關鍵技術及新技術。本書涵蓋了動物細胞製藥基因工程近年來的最新的關鍵技術及相關進展，可作為從事生物製藥、基因工程等領域工作的科研人員、專業技術人員及相關專業的教師和學生的參考用書。

作者介紹

王天雲

博士，教授，博士生導師。新鄉醫學院“太行學者”特聘教授。河南省重組藥物蛋白表達系統國際聯合實驗室及生物創新藥物工程技術研究中心主任，中國生物化學與分子生物學會理事，河南省生物化學與分子生物學會理事長，教育部“長江學者”，國家科技進步獎評審專家。主持國家自然科學基金4項，省重大科技專項1項，創新傑出人才專案1項；參與國家“863”課題、國家重大科技專項各1項。獲省科技進步二等獎2項、三等獎1項。申請國家發明專利35項，已授權16項。發表研究論文86篇，其中SCI收錄53篇，被引1076次。長期從事哺乳動物細胞表達系統的研究，建立了國際水準的哺乳細胞表達系統，包括高效表達載體、細胞系及培養基。已實現技術轉移2項，專利轉化8項。

第一章動物細胞培養 001
第一節動物細胞培養基礎知識 002
一、基本概念 002
二、動物細胞培養條件 003
三、動物細胞培養實驗室 004
四、無菌技術 006
第二節動物細胞培養技術 007
一、動物細胞凍存與復蘇 007
二、動物細胞傳代 009
三、動物細胞懸浮馴化及無血清培養 011
四、動物細胞分批培養 015
五、動物細胞補料分批培養 016
六、動物細胞灌流技術培養 022
第三節動物細胞生物特性分析 025
一、動物細胞生長曲線和倍增時間分析 025
二、動物細胞增殖測定 028
三、動物細胞凋亡檢測 031
四、動物細胞週期檢測 036
參考文獻 038

第二章動物細胞載體 041
第一節質粒載體構建 042
一、目的基因獲取 042
二、限制性內切酶酶切 046
三、目的片段和載體連接 048
四、重組子轉化 050
五、重組載體篩選 052
六、重組載體鑒定 052
第二節病毒載體構建 056
一、杆狀病毒表達載體 056
二、慢病毒載體 057
三、腺病毒載體 059
四、逆轉錄病毒載體 060
參考文獻 061

第三章目的基因導入 065
第一節動物細胞轉染 066
一、脂質體轉染 066
二、聚乙烯亞胺轉染 067
三、電穿孔轉染 068
四、影響細胞轉染的因素 069
第二節細胞轉染效率檢測 070
一、流式細胞儀檢測 071
二、螢光顯微鏡檢測 071
參考文獻 072

第四章重組穩定細胞株篩選和評估 075
第一節重組穩定細胞池篩選 076
一、常用的抗生素篩選標記 076
二、遺傳黴素篩選 078
三、DHFR篩選 079
四、GS篩選 080
第二節重組單克隆細胞株分離 081
一、有限稀釋法 081
二、流式細胞螢光分選技術 082
三、ClonePix 083
四、克隆環法 084
五、其他篩選方法 085
第三節重組穩定細胞系評估 086
一、細胞污染檢測 086
二、細胞系鑒定 087
三、外源基因整合分析 089
四、重組蛋白表達分析 098
參考文獻 101

第五章重組蛋白分離純化 103
第一節重組蛋白純化策略及設備 104
一、重組蛋白純化策略 104
二、重組蛋白純化設備 107
第二節重組蛋白沉澱和膜分離技術 116
一、蛋白質沉澱法 117
二、膜分離技術 118
第三節重組蛋白分離色譜技術 119
一、親和色譜法 120
二、疏水色譜法 122
三、凝膠過濾色譜法 124
四、離子交換色譜法 126
五、反相色譜法 129
參考文獻 131

第六章重組蛋白藥物鑒定與分析 135
第一節蛋白質理化特性 136
一、分子量測定 136
二、等電點與電荷異質性分析 141
三、肽圖分析 144
四、氨基酸組成分析 145
五、N端氨基酸測序 150
六、C端氨基酸測序 152
七、二硫鍵分析 153
八、高級結構分析 155
第二節蛋白質含量分析 159
一、凱氏定氮法 159
二、Lowry法 161
三、BCA法 162
四、Bradford法 164
五、紫外吸收法 166
六、高效液相色譜法 166
第三節蛋白質純度分析 168
一、宿主細胞蛋白殘留分析 168
二、宿主細胞DNA殘留分析 170
三、殘留抗生素檢測 172
四、其他成分檢測 173
第四節糖基化修飾分析 181
一、分離富集親和技術 182
二、糖蛋白鑒定/糖基化位點的確定方法 187
三、糖鏈結構分析 189
第五節生物學活性測定 206
一、體外法評估 207
二、體內法評估 211
第六節免疫化學特性分析 213
一、親和力測定 213
二、抗原結合表位測定 217
參考文獻 219

第七章重組蛋白藥物新技術 223
第一節人工智慧與蛋白藥物設計 224
一、核苷酸及蛋白質相關資料庫 224
二、基因資訊分析及密碼子優化 226
三、蛋白質資訊分析及結構預測 241
四、人工智慧設計 255
第二節 miRNA篩選與應用 269
一、miRNA篩選 269
二、miRNA應用 273
第三節基因編輯技術 279
一、動物細胞CRISPR基因敲除 279
二、動物細胞基因敲入 289
第四節表觀遺傳學技術 299
一、DNA甲基化分析 299
二、組蛋白修飾分析 305
三、非編碼RNA分析 314
第五節 DNA與蛋白質相互作用分析 323
一、凝膠遷移實驗 323
二、DNaseⅠ足跡實驗 330
三、酵母單雜交系統 337
四、染色質免疫沉澱 351
五、噬菌體展示技術（DNA與蛋白質相互作用） 354

參考文獻 356
附錄1 常用緩衝液及試劑的配製 363
附錄2 中英文詞彙表 369

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